蛋白质组学质谱数据分析概述

1.蛋白质鉴定:一维电泳和二维电泳结合西方技术,蛋白质芯片、抗体芯片、免疫共沉淀技术可用于蛋白质的鉴定。

2.翻译后修饰:许多mRNA表达产生的蛋白质必须经历翻译后修饰,如磷酸化、糖基化和酶原激活。翻译后修饰是蛋白质调节其功能的重要方式,因此研究蛋白质的翻译后修饰对阐明蛋白质的功能具有重要作用。

3.蛋白质功能的测定:如酶活性的分析和酶底物的测定,细胞因子的生物学分析/配体-受体结合分析。基因敲除和反义技术可用于分析基因表达产物蛋白质的功能。此外,对蛋白质表达后在细胞中定位的研究在一定程度上有助于了解蛋白质的功能。Clontech的荧光蛋白表达系统是研究蛋白质在细胞中定位的良好工具。

4.就人类而言,蛋白质组学的研究最终将服务于人类健康,这主要意味着促进分子医学的发展。例如寻找药物的目标分子。很多药物都是蛋白质,很多药物的靶分子都是蛋白质。药物也会干扰蛋白质间的相互作用。

在基础医学和疾病机理的研究中,了解不同发育阶段、不同生理病理条件和不同细胞类型的基因表达特征具有重要意义。这些研究可能会发现与特定生理或病理条件直接相关的分子,并进一步为设计作用于特定靶分子的药物奠定基础。不同细胞类型的基因表达在不同发育阶段和不同生理病理条件下是不一致的,因此对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平。免疫组织化学技术可用于实现这一目标,但其致命的缺点是通量低。激光捕获显微切割(LCM)技术可以从组织切片中准确提取研究人员感兴趣的细胞类型,因此LCM技术实际上是一种原位技术。提取的细胞用于制备蛋白质样品。结合抗体芯片或双向电泳-质谱技术,可以通过高通量原位研究蛋白质的表达。很多研究都是用匀浆组织来制备蛋白质样品,结论是值得商榷的,因为不同细胞类型的蛋白质在匀浆组织后混合在一起,最终的研究数据根本无法解释每种细胞类型中蛋白质的表达情况。虽然通过培养细胞可以获得单一类型的细胞,但体外培养的细胞很难模拟体内细胞的环境,因此这项研究得出的结论也很难解释体内的实际情况。所以在研究中首先要分离不同的细胞类型,分离出来的不同细胞类型可以用于基因表达研究,包括mRNA和蛋白表达。

通过LCM技术获得的细胞可用于制备蛋白质样品。总蛋白、膜蛋白、核蛋白等。可以根据需要制备,也可以富集糖蛋白,或者通过去除白蛋白降低蛋白种类的复杂性。相关套件由制造商提供。蛋白质样品中不同类型的蛋白质可以通过二维电泳分离。双向电泳可以根据等电点和分子量的差异,高分辨率地分离不同种类的蛋白质。成功的双向电泳可以分离2000到3000种蛋白质。电泳后的胶进行高灵敏染色,如银染、荧光染色等。如果比较两个样本蛋白质表达的异同,可以在相同条件下制备两个样本的蛋白质样本,然后在相同条件下进行双向电泳,染色后比较两块胶。也可以用不同的荧光染料标记两个样本的蛋白质样本,然后在一块胶上用二维电泳分离两个蛋白质样本,最后用荧光扫描技术分析结果。

胶染后可以用凝胶图像分析系统成像,然后用分析软件对蛋白点进行定量分析,定位感兴趣的蛋白点。通过特殊的蛋白点切割系统,可以精确切割蛋白点所在的胶区。然后,通过酶消化来消化胶中的蛋白质,并且在脱盐/浓缩处理之后,可以通过点样系统将蛋白质点样在特定材料(MALDI-TOF)的表面上。最后,这些蛋白质可以在质谱系统中进行分析,从而获得蛋白质的定性数据;这些数据可用于建立数据库或与现有数据库进行比较。

LCM-双向电泳-质谱技术路线是蛋白质组学研究的典型技术路线。此外,LCM-抗体芯片也是蛋白质组学研究的重要技术路线。即,通过LCM技术获得感兴趣的细胞类型,并制备细胞蛋白质样品。用荧光染料标记蛋白质,并与抗体芯片杂交,这样就可以比较两种样品蛋白质表达的异同。Clontech最近开发了一种抗体芯片,可以分析378种膜蛋白和细胞质蛋白。同时,芯片配备了抗体芯片整个操作过程中的重要试剂,包括蛋白制备试剂、蛋白荧光染料标记试剂、标记体系纯化试剂、杂交试剂等。

对于蛋白质相互作用的研究,酵母双杂交和噬菌体展示技术无疑是很好的研究方法。Clontech公司开发的酵母双杂交系统和NEB公司开发的噬菌体展示技术可供研究人员使用。

对于蛋白质组的研究,来自蛋白质组的部分或全部蛋白质也可以制成蛋白质芯片,这种蛋白质芯片可以用于蛋白质相互作用研究、蛋白质表达研究和小分子蛋白质结合研究。《科学》293卷5537期2101-2105年9月14日2001发表了一篇关于酵母蛋白芯片的论文。论文的主要内容如下:将酵母的5800个orf表达成蛋白质,然后纯化制成芯片,再用芯片筛选与钙调素和磷脂分子相互作用的分子。

最后,需要指出的是,传统的蛋白质研究侧重于单个蛋白质,而蛋白质组学则侧重于参与特定生理或病理状态的所有蛋白质种类及其与周围环境(分子)的关系。因此,蛋白质组学的研究通常是高通量。为了满足这一要求,蛋白质组学相关的研究工具通常是具有高通量和高速度的高度自动化的系统。有了相应的分析软件和数据库,研究人员可以在最短的时间内处理最多的数据。